Senin, 19 Desember 2011

Escherichia Coli dan Coliform sp.


Escherichia (Escherichia coli) merupakan salah satu kelompok bakteri yang dihindari kehadiranya dalam komunitas manusia. Kehadiran kelompok bakteri ini digunakan sebagai indikator suatu produk telah tercemar oleh materi fekal, yaitu materi yang berada bersama feses atau kotoran manusia. Hal ini disebabkan habitat alami kelompok bakteri ini adalah didalam tinja manusia dan hewan berdarah panas lainya.
Coliform merupakan suatu kelompok bakteri yang digunakan sebagai indikator adanya polusi kotoran dan kondisi sanitasi yang tidak baik terhadap air, susu segar, dan produk olahan susu. Adanya bakteri coliform didalam makanan atau minuman menunjukkan kemungkinan hidupnya mikroorganisme yang bersifat enteropatogenik / toksigenik yang sangat berbahaya bagi kesehatan manusia. Jenis-jenis dari kelompok ini antara lain adalah Aerobacter dan Klebsiella .
              Berdasarkan asal dan sifatnya, kelompok bacteri  Coli dibagi menjadi dua golongan, yaitu :
1. Coliform fekal         : Escherichia Coli yang berasal dari tinja manusia.
2. Coliform non fekal   : Seperti Aerobacter dan Klebsiella , yang bukan berasal dari tinja manusia,      tetapi dimungkinkan berasal dari sumber lain. Atau ditemukan pada      hewan atau tanaman yang telah mati dan termasuk dalam golongan           Enterobacter aerogenes .
              Kehadiran bacteri Coli sangat besar pengaruhnya terhadap kehidupan manusia, terbukti kualitas air minum secara bacteriologis ditentukan oleh bacteri tersebut, seperti terlihat pada  Tabel. 1 Kualitas Air Minum Berdasarkan Kandungan Bakteri Coli.
              Ketentuan nilai atau kualitas air, dapat juga ditentukan berdasar nilai Indeks Pencemaran Biologis (IPB) atau BIP (Biological Indeces Polution ). Perhitungan ini didasarkan kepada perbandingan kehadiran mikroba berkhlorofil (misal mikroalge) dan tanpa khlorofil (misal bacteria dan jamur, sehingga hasilnya berbentuk nilai indeks yang dihitung menggunakan rumus berikut ini:

                    nilai IPB  =      B       x 100
                                        A + B
KUALITAS  AIR  BERDASARKAN  JUMLAH  COLI  per 100 ml
KUALITAS AIR
JUMLAH BACTERI COLI PER 100 ML
Sangat memuaskan
Kurang dari 1 (tidak ada )
Memuaskan
1 - 2
Diragukan
3 - 10
Jelek
Lebih dari 10

1. SIFAT  UMUM
1.1. Hanya hidup pada usus manusia dan binatang. Merupakan bakteri berbentuk batang gram negatif  yang bergerak menggunakan flagel peritrik dan tidak berspora.
1.2. Bersifat aerob atau anaerob fakultatif, memfermentesi lactosa, glukosa, sukrosa, maltosa dan manitol dengan membentuk asam dan gas. Karakteristik khasnya adalah mampu memfermentasi media indol dan merah methyl (indol dan merah methyl positif), akan tetapi tidak mampu memfermentasi media VP dan Citrat (Voges Proskauer dan Citrat negatif) dan tumbuh pada pembenihan biasa.
1.3. Berbentuk batang gemuk pendek, berukuran panjang 2,4 µm dan lebar 0,4 µm hingga 0,7 µm, gram negatif  tak bersimpai dan bergerak aktif.
1.4. Pertumbuhan pada biakan cair menunjukkan kekeruhan setelah diinkubasi selama 8 - 24 jam.
1.5. Bakteri ini dapat bertahan berbulan-bulan pada tanah dan di dalam air, tetapi dapat dinaktifkan dengan pemanasan pada suhu 600C selama 20 menit, atau dengan pemberian chlorin berkadar 0,5 - 1 ppm. Bakteri ini peka terhadap streptomisin, tetrasiklin, kloramfenikol, furadantin dan asam nalidiksat .

2. KLASIFIKASI
2.1 . Beradasarkan kemampuan merombak laktosa :
2.1.1.  Lactose Fermentor          :Escherichia sp.
                                              Klebsiella.sp.
2.1.2. Fermentor laktosa lambat  :Shigella sonnei
                                              Paracolon
2.1.3. Non Lactose Fermentor     :Salmonella
                                              Shigella                       

3. HABITAT
3.1. Bakteri E.Coli atau Coliform Fekal hanya ditemukan dalam saluran usus hewan atau manusia. Istilah “fekal” diambil dari suatu materi yang berada bersama feses atau kotoran manusia
3.2. Bacteri Coliform Non Fekal meliputi spesies Enterobacter yaitu Enterobacter aerogenes. Flora alaminya pada tanaman atau hewan yang telah mati dan sering menimbulkan lendir pada makanan.

4.  FAKTOR  PERTUMBUHAN
          Kelompok jenis bakteri basili gram negatif anaerobik fakultatif, umumnya tumbuh pada kondisi aerob maupun anaerob. Pada kondisi aerob, bakteri ini mengoksidasi asam amino, sedangkan jika tidak terdapat oksigen, metabolisme bersifat fermentatif, dan energi diproduksi dengan cara memecah gula menjadi asam organik.
          Metode yang digunakan untuk membedakan Coliform fekal (Escherichia coli) dan Coliform non fekal (Enterobacter aerogenes) adalah dengan melihat perbedaan kebutuhan dasar metabolisme kedua organisme tersebut. E. coli melakukan metabolisme lebih banyak didalam media glukosa, yang dapat dilihat dari indikator merah methyl positif, memproduksi indol, tetapi tidak memproduksi acetoin (acetil methyl karbinol). Bakteri ini juga memproduksi CO2 dan H2 dengan perbandingan 1:1, dan tidak dapat menggunakan Citrat sebagai sumber metabolisme. Enterobacter aerogenes memproduksi lebih sedikit asam, membentuk acetoin, tetapi tidak membentuk indol. Organisme ini memproduksi CO2 dan H2 dengan perbandingan 2:1, dan dapat menggunakan Citrat sebagai sumber metabolisme. Organisme ini juga memproduksi gas lebih banyak dari pada E. coli.
          Faktor lingkungan yang menjadi kebutuhan dasar metabolisme Organisme E. coli dan Coliform adalah sebagai berikut :
a. Suhu optimum 370C.
b. Derajat keasaman (pH) optimum pertumbuhan 7 (pH netral).
c. Water activity (aw) optimum 0.90-0.95.
d. Dapat hidup dalam kondisi aerob maupun anaerob.

5. PATHOGENESIS
5.1 Kemampuan Memproduksi Racun (Toksin)
Organisme ini mampu memproduksi endotoksin, disamping itu juga memproduksi eksotoksin :
5.1.1. Enterotoksin Termolabil, toksin keluar melalui membran sel bakteri dan menyebabkan pengumpulan cairan pada lengkung ileum kelinci. Cara kerjanya adalah dengan mengaktifkan enzim adenil siklasa, dengan cara menaikkan kadar C-AMP pada sel dan menyebabkan pengeluaran cairan dan elektrolit pada rongga usus.
5.1.2. Hemolisin , dimungkinkan berupa:
5.1.2.1. Zat Thermolabil, toksin keluar melalui membran sel bakteri dan lethal (mampu meracuni) binatang percobaan.
5.1.2.2. Toksin yang dihasilkan sel bacteri tetapi tidak keluar melalui membran sel bakteri.
5.2. Grastrointeritis                                                         
          Organisme ini dapat menyebabkan gejala gastrointestinal (terinfeksinya saluran pencernaan manusia). Akibat dari gejala ini yang paling umum adalah wabah diare, terutama pada anak-anak usia balita dan manula. Jenis-jenis organisme E. coli yang menyebabkan gastroenteritis pada anak usia balita yang bersifat sangat fatal adalah Type 4, 26, 46, 55, 86, 111, 112, 119, 127, 129.   
          Pada musim panas, kadang-kadang terjadi juga wabah diare. Akan tetapi diare ini tidak disebabkan karena terinfeksinya saluran pencernaan oleh bakteri pathogen, tetapi dikarenakan produksi asam laktat akibat fermentasi laktosa didalam usus besar yang mengakibatkan terjadinya mual hebat, muntah-muntah dan diare.

5.3.  Infeksi saluran kemih                                               
          Escherichia coli  yang berpotensi menyebabkan infeksi saluran kemih ialah Type O, 1, 2, 4, 6, dan 7. Jenis-jenis organisme pembawa antigen K dapat menyebabkan timbulnya pieloefritis (penyumbatan saluran kemih karena adanya pembesaran kelenjar prostase). Penyumbatan ini dapat terjadi apabila jumlah organisme E. coli didalam air kemih meleihi 100.000 cfu/ml.

5.4. Infeksi piogenik                                                        
          Organisme Escherichia coli dapat menginfeksi luka, menyebabkan peritonitis, kolesistitis, meningitis, serta septikemia.

6. PENCEGAHAN
   
                Setelah mengetahui tingkat bahaya yang ditimbulkan oleh organisme coli dan coliform, diperlukan pengetahuan untuk meminimalisir kehadiran organisme tersebut dalam makanan ataupun lingkungan tinggal populasi manusia. Seperti yang telah diutarakan diatas, organisme ini dapat tahan berbulan bulan pada tanah dan didalam  air, tetapi dapat dimatikan dengan pemanasan pada suhu 600C selama 20 menit atau dengan pemberian chlorin dalam kadar 0,5 – 1 ppm. Selain itu, organisme ini peka terhadap streptomisin, tetrasiklin, kloramfenikol, furadantin dan asam nalidiksat. Dari pengetahuan dasar tersebut, maka diketahui mekanisme-mekanisme sederhana yang mampu meminimalisir ataupun mensucihamakan makanan atau lingkungan dari organisme tersebut. Berikut langkah-langkah sederhana yang bisa diterapkan dalam kehidupan sehari-hari:                                        
6.1. Bersihkan bahan pangan yang akan diolah.
6.2. Bahan pangan harus dimasak sempurna.
6.3. Tidak menyimpan bahan makanan mentah, setengah jadi, ataupun makanan jadi pada tempat yang berpotensi terkontaminasi organisme tersebut.
6.4. Mensucihamakan peralatan yang kontak langsung dengan makanan menggunakan bahan pensuci hama (ex. detergent, chlorin, sanitizer) atau dengan perlakuan fisik (ex. pemanasan).

7. PENGOBATAN

          Untuk menentukan metode pengobatan yang tepat, perlu diketahui dahulu tingkat resistensi organisme tersebut terhadap beberapa bahan kimia. Organisme coli dan coliform peka terhadap sulfanomida, trimetopin, tetrasiklin, kloramfenikol dan aminoglikosida. Untuk pengobatan infeksi saluran kemih dianjurkan penggunaan nitrofurantoin atau asam nalidiksat. Pada septicemia atau infeksi berat harus segera diberikan pengobatan tanpa menunggu hasil pemeriksaan kepekaan terhadap antibiotika. Sebagai jalan pintas, dapat digunakan  gentamisin. Gentamisin adalah antibiotika yang paling kuat (belum banyak ditemukan bacteri yang kebal terhadapnya ).

 8.  ANALISA  COLIFORM  DAN  ESCHERICHIA  COLI
    Secara garis besar analisa Coliform dan Escherichia coli menggunakan media cair dan menggunakan media agar. Berikut disampaikan paparan mengenai media cair dan media padat untuk analisa Coliform dan Escherichia coli. 
1.    Media Cair
1.1. MacCONKEY Broth
Pada awalnya, pada tahun 1885, seorang ilmuwan bernama Theobald Smith mengemukakan pendapat, bahwa E. coli merupakan isi alami pada usus manusia dan hewan, dan apabila keluar, mereka menjadi organisme yang mencemari sanitasi lngkungan. Beberapa waktu berselang tepatnya pada tahun 1901, MacCONKEY dan HILL berhasil memformulasi media bgi organisme yang mampu memfermentasi laktosa dan toleran terhadap garam. Penemuan ini sangat penting sebagai tonggak penggunaan media cair untuk analisa Coliform dan E.coli.
MacCONKEY broth terdiri dari 3 unsur penting yang saling menunjang, yaitu laktosa, garam dan indikator. Laktosa, berfungsi sebagai agent yang bila terdegradasi akan memproduksi gas. Gas tersebut menunjukkan pertumbuhan E. coli, gas yang terbentuk ditampung dalam tabung durham. Garam, dalam hal ini digunakan “ox bile” berfungsi sebagai selective agent. Garam menghambat pertumbuhan beberapa organisme pencernaan, tetapi tidak untuk E. coli. Sedangkan bromocresol purple bertindak sebagai indikator. E. coli yang hidup akan memproduksi asam, karena asam tersebut, bromocresol purple berubah warna dari ungu ke kuning.
Pada awalnya MacCONKEY menggunakan litmus sebagai indikator produksi asam menjadi laktosa. Namun, penggunaan litmus perlahan-lahan diganti neutral red sebagai bahan alternatif. Penggunaan neutral red dirasa kurang efektif, menurut Childs dan Allen, neutral red tidak stabil, berubah-ubah dan cenderung menghambat pertumbuhan E. coli. Akhirnya dipilihlah bromocresol prurple untuk menggantikan netral red. MacCONKEY dengan indikator bromocresol purple lebih sensitif terhahap asam, dan menampilkan perubahan warna yang tidak berubah-ubah, stabil dan sanat mencolok dari ungu ke kuning. Meskipun demikian penggunaan neutral red juga masih dipertahankan.
Dalam perkembangannya, media MacCONKEY  broth mengalami beberapa modifikasi. Jamesson dan Emberelly mengganti penggunaan garam dengan detergetn tak berion sebagai selective agent. Natrium Lauryl Sulphate dan Natrium Lauryl Tryptone adalh detergent ayng banyak digunakan. Selain itu laktosa sebagai fermenting agent, dikembangkan dengan penggunaan mannitol. Pengembangan tersebut sangat berguna untuk deteksi strain Non-lactose fermentor bacteria, semisal E. coli 0157:H7 (mannitol fementor).
2.    Briiliant Green Lactose Bile Broth
Media Brilliant Green Lactose Bile Broth merupakan generasi penerus dari Media MacCONKEY broth. Pada tahun 1920-an, media BGLBB mulai dikenalkan sebagai media deteksi dan konfirmasi anggota grup aerogenes. Berebda dengan MacCONKEY Broth, Briliant Green Lactose Bile Broth tidak menggunakan indikator. Komponen utamanya adalah laktosa (fermenting agent), garam (selective agent), dan brilliant green (completely selective agent).
Keunikan dari media ini terdapat pada keseimbangan penghambatan brilliant green dan garam. Pada tahun 1948, MACKENZIE mengutarakan : Garam dan brilliant green sangat sempurna menghambat pertumbuhan organisme clostridia yang mendegradasi laktosa (lactose-degrading clostridia) seperti Clostridium perfingens. Cl. perfingens sering menyebabkan kesalahan hasil positif pada tabung durham, karena dapat memfermentasi laktosa dan menghasilkan gas.
Gas yang terbentuk, sebenarnya berasal dari reaksi biokimia yang sangat rumit dan kompleks. Namun secara prinsip, dasar reaksinya dapat dilihat pada tahapan reaksi berikut ini:
a. Proses Hidrolisa Laktosa
Laktosa yang terkandung dalam media cair dihidrolisa oleh Escherichia coli dan menghasilkan Galktosa dan Glukosa.
Reaksi!!!!
b. Glikolisis
Glukosa hasil hidrolisa laktosa tersebut selanjutnya mengalami glikolisis. Proses glikolisis melibatkan enzym mikroba, dan menghasilkan asam piruvat.
REAKSI!!!!!
c. Fermentasi
Asam piruvat yang terbentuk, kemudian mengalami fermentasi lebih lanjut secara aerobik dan menghasilkan asam asetat dan gas karbondioksida (CO2). Dan gas yang terbentuk ditampung dalam tabung durham dan menandakan E. coli positif.
REAKSIII!!!!
3.    Enterobactericeae Enrichment Broth (EE Broth)
Pada tahun 1963, Mossel memperkenalkan sebuah media yang digunakan sebagai pendeteksi Enterobactericeae. Pronsip dasar media ini hampir sama dengan media pendahulunya, hanya penggunaan laktosa diganti dengan penggunaan glukosa.
Glukosa digunakan untuk memecahkan masalah yang muncul a[abila Enterobacteria tidak memfermentasi laktosa sama sekali (lactose-negative), memfermentasi laktosa pada kondisi an aerogenik (an aerogenic lactose-positif), ataupun memfermentasi laktosa secara lambat (late lactose fermenting), sehingga tidak terdeteksi pada “coli aerogenes test”. Untuk mengatasinya laktosa dalam media diganti dengan glukosa.
Suatu pembuktian yang sangat nyata diutarakan oleh Mossel pada tahun 1964, dia menemukan penyakit diare yang disebabkan oleh keju yang terkontaminasi E. coli serotype 0124. Organisme ini tidak memfermentasi laktosa (lactose negative) dan tidak terdeteksi pada Coliorm test. Tapi akhirnya
4.     










8.2.Metode hitungan cawan
    
  Jumlah koliform didalam contoh dapat dihitung dengan metode hitumgan cawan , menggunakan

8.2.1.Agar VRB (Violet Red Bile )
8.2.2.Agar DL ( Desoxycholat Lactose )
8.2.3.CHROMOCUL COLIFORM AGAR

8.2.1.Dalam menggunakan Agar pada poin 8.2.1 dan 8.2.2 , setelah agar membeku pada bagian atasnya dituangkan lagi medium yang sama sebanyak 4-5 ml percawan berdiameter 10cm , sehingga diperoleh lapisan tipis pada permukaan agar , dan koloni tumbuh dibawah permukaan agar ( Sub permukaan )



  Kedua medium tersebut mengandung komponen yang menghambat pertumbuhan bacteri gram positif , yaitu masing masing garam bile sebanyak 0.15% pada agar VRB , dan natium desoksikholat sebanyak 0.05% pada agar DL . Bacteri memfermentasi laktosa , termasuk coliform , akan membentuk koloni spesifik pada subpermukaan , yaitu berwarna tua dengan berdiameter 0.05 mm atau lebih, dan dikelilingi oleh area yang menunjukkan pengendapan indicator ( merah netral ) dengan bile atau desoksikholat .
 
  Inkubasi cawan yang mengandung agar VRB atau Agar DL harus dilakukan pada suhu 350C atau 370C selama 24 jam atau kurang  . Pada inkubasi yang terlalu lama , bacteri gram negatif lainnya mungkin tumbuh  sehingga akan membingungkan dalam menghitung koloni yang spesifik koliform .

8.2.3.CCA (Chromocul Coliform Agar
    
     CCA (Chromocul Koliform Agar ) adalah media yang sangat selektif untuk  uji analisa koliform  , dimana kebanyakan bacteri bentuk gram positif . dihambat pertumbuhannya . CCA (Chromocul Coliform Agar ) mengadung TergitolR7 ,dimana komponen tersebut merupakan faktor penghambat pertumbuhan bacteri selain e,coli , coliform
  Karaktersik pertumbuhan coliform pada  Chromocul coliform agar  adalah berwarna merah solmon , sedangkan e coli berwarna biru gelap ke violet .
     
        9.TUJUAN ANALISA

9.1. Untuk mengetahui apakah bahan pangan tersebut terkontaminasi oleh suatu bacteri jenis coliform atau E coli
9.2. Untuk menghitung atau mengukur jumlah bacteri , yang mungkin masih hidup atau tertinggal , setelah dilakukan proses pemasakan dan pengolahan bahan pangan tersebut .
9.3. Untuk menjamin bahwa bahan pangan tersebut aman untuk dikonsumsi .

10. TAHAPAN ANALISA ( dengan media chromocul coliform agar )


10.1. Pengolahan bahan pemeriksaan
10.2. Penyehatan bacteri
10.3. Tahap penanaman pada media selektif .
10.4. Identifikasi .
10.5 Tahap pmeriksaan serologi .




10.1. Pengolahan bahan pemeriksaan
       
        Suspensikan 1 : 10 dari contoh tersebut kemudian kocok pada alat pengocok sehingga didapatkan  contoh yang homogen .

10.2.  Penyehatan bacteri
         
        Resusitasikan contoh selama 1 sampai 2 jam , dimana selama proses  pengolahan dan pemanasan kemungkinan besar bacteri menjadi stress dan sekarat , dengan adanya perlakuan penyehatan, bacteri akan sehat kembali .dan adanya batasan waktu 1 sampai 2 jam supaya jumah bacteri yang dianalisa belum mengalami germinasi  dimana bacteri akan menjadi banyak , yang akan mnyulitkan dalam pengamatan .

10.3. Tahap penanaman pada media selektif .
       
        Inokulasi media denga metode pour plate , yaitu  dari contoh uji , kemudian tuangkan media chromocul coliform agar sebanyak 12 ml atau denga metode spreade pada permukaan cawan . Inkubasi pada suhu 350C sampai 370C selama 24 jam . Karasteristik koliform berwarna merah solmon dan e coli berwarna biru gelap ke violet .
        Untuk konfermasi , koloni yang diduga E coli teteskan beberapa tetes larutan covaks indol reagen , jika ada perubahan warna menjadi merah solmon setelah ditetesi kovaks beberapa menit , maka diduga E coli positif untuk selanjutnya konfermatif test.

10.4. Tahap Indentifikadsi .
       
        Mikroorganisme tumbuh dan berkembangbiak dengan menggunakan berbagai bahan yang terdapat dilingkunganya . Zat hara yang terdapat dilingkungan sekelilingnya terdiri dari molekul sederhana seperti H2S dan NH2 + , atau molekul organic yang kompleks seperti protein dan polisakarida . Mikroba mengoksidasi zat hara ini untuk memperoleh energi dan senyawa pemula untuk sintesis dinding sel , membran dan flagella .
                Penggunaan zat hara tergantung aktifitas metabolisme mikroba . Metabolisme seringkali menghasilkan hasil sampingan yang dapat digunakan untuk identifikasi mikroorganisme .
        Pembahasan berikut ini mencakup berbagai uji untuk mengetahui aktifitas metabolisme bacteri coliform dan e coli .
             Pada prinsip metode MPN ada beberapa tahapan yang harus dilakukan yaitu : Uji penduga koliform , uji penguat koliform , dan uji lengkap koliform , tetapi pada metode agar tuang , dari koloni yang tumbuh pada media agar yang diduga koliform atau e coli langsung ditanam pada agar miring , inkubasi pada suhu 350C selama 24 jam kemudiasn lakukan Identifikasi lengkap

                                                                      
10.4.1.IMViC TEST
         
        Merupakan singkatan dari uji Indol , Methyl Red , Voges Proskaeur , dan Citrate . Uji yang dilakukan untuk mengetahui jenis koliform yang terdapat dalam contoh .dari suspensi agar miring masing – nasing diinokulasikan menggunakan jarum ose kedalam tiga tabung yang berisi media yang berbeda

10.4.1.1. Indol test.
            
            Media Tryptone broth  mengandung protein asm amino tryptofan yang merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein .sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein       
              Escherichia Coli atau fekal dapat memecah asam amino tryptofan , sebagai sumber karbon .
          
           Dari isolate yang ditumbuhka pada agar miring , ambil satu lop penuh inokulasikan pada media tryptone broth, inkubasi pada suhu 350C selama 48 jam . kemudian tambahkan 3-5 tetes periaksi kovaks reagen  yang mengandung amil alkohol
           Adanya Indol akan menyebabkan amil alkoholmberubah warnanya menjadi merah tua . E.coli menghasilkan enzim tryptofanase yang mengkatalisasikan penguraian gugus Indol dari tryptofan  . Dalam media biakan , Indol menumpuk sebagai produk buangan , sedangkan bagian lainnya dari molekul tryptofan ( asam piruvat dan NH4+ ) dapat digunakan untuk memenuhi kebutuhan zat hara mikroorganisme .


Cara Mengerjakan
          
                1. Tandai tabung dengan nomor , tanggal dan mikroorganisme      yang  digunakan
                2. Inokulasikan biakan pada media Tryiptone broth( Indol )
                3. Inkubasi pada suhu 350C selama 24 – 48 jam .

Hari Kedua .

     4. Tambahkan 3-5 tetes periaksi kovaks reagen penumpukan        Indol dalam media ditandai dengan warna cincin merah   pasda pewrmukaan media setelah beberapa menit .


10.4.1.2.MR-VP Test.

10.4.1.2.1.MR Test.
             
              Uji methyil red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam campuran  Beberapa bacteri memfermentasikan glukosa dan menghasilkan berbagai produk yang bersifat asam sehingga akan menurunkan Ph media pertumbuhan menjadi 5.0 atau lebih rendah . Penambahan indicator “ methyl red “ dapat menunjukkan adanya perubahan pH menjadi asam  . Methyl Red berwarna merah pada lingkungan dengan Ph 4.4 dan berwarna kuning dengan ph 6.2 . Fermentasi asam campuran ditentukan denga cara menumbuhkan mikroorganisme kedalam kaldu yang mengandung glukosa , dan setelah masa inkubasi tambahkan Reagan Methyl Red kedalam kaldu . Bila terjadi fermentasi asam campuran kaldu biakan akan tetap berwarna merah . Bila tidak terjadi fermentasi asam campuran maka kaldu biakan berubah menjadi warna kuning setelah penambahan reagen Methyl Red . Uji ini sangat berguna dalam identifikasi kelompok bacteri yang menempati saluran pencernaan .
             
              Cara mengerjakan :
             
              a.Media – Kaldu MR-VP
              b.Reagen- Methyl  Red.

  1. Tandai tabung kaldu MR-VP dengan bacteri yang                        digunakan
2. Inokulasi kaldu MR-VP denghan biakan bacteri
3.. Inkubasikan  pada suhu 350C selama 48 jam
4. Tambahkan 5 tetes reagen Mthyl Red kewdalam tabung MR-VP kemudian Inkubasi lagi selama 72 jam jadi total masa inkubasi adalah 120 jam atau 5 hari .


     -Uji bersifat positif bila kaldu berwarna merah setelah penambahan reagens Methyl Red .
    
-         Uji bersifat negatif bila kaldu MR-VP berubahanwarna menjadi kuning atau jingga setelah penambahan reagens  .



10.4.1.2.2.VP Test ( Voges Proskauer )

              Uji ini digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme yang melakukan fermentasi 2,3 butanadiol . Bila bacteri memfermentasikan karbohidrat menjadi 2,3 butanadiol sebagai produk utama , akan terjadi penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan  dengan penambahan 40% KOH dan 5% larutan alphanaphtol dalam ethanol dapat menentukan adanya asetoin  ( asetilmetilkarbinol ) , yaitu suatu senyawa pemuka dalam sentisis 2,3 butanadiol
              Pada penambahan KOH , adanya asetoin ditunjukkan oleh perubahan warna kaldu menjadi merah muda . Perubahan warnaini diperjelas dengan penambahan larutan alpha naphtol . Perubahan warna kaldu biakan lebih jelas pada bagian yang berhubungan dengan udara karena , bagian 2,3 butanadiol dioksidasikan kembali menjadi asetoin sehingga memperjelas hasil reaksi . Berdasarkan hal ini tabung yang berisi kaldu dikocok sehingga berbuih , kemudian dibuka tutup tabungnya dan miringkan diatas meja .

              Bahan yang diperlukan :
            
              a. Kaldu MR-VP ( Methyl Red – Voges Proskauer)
              b. Larutan  40% KOH
              C.Larutan  5% alpha-naphtol .


Cara mengerjakan :


                  1. Tandai kaldu MR-VP dengan biakan bacteri yang                
                      digunakan .
2. Inokulasi kaldu MR-VP dengan biakan bnacteri .
3. Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu 350C                     
4. Tambahkan 10 tetes larutan 40% KOH dan 15 tetes larutn alpha naphtol dalam kaldu MR-VP.
   Kocok tabung sehingga kaldu terlihat berbuih . Pengocokan dengan baik meningkatkan aerasi , sehingga terjadi peningkatan oksidasi 2,3 butanadiol menjadin asetoin  dan memperjelas hasil reaksi uji ini.

   Hasil reaksi dapat terlihat paling lambat setelah 30 menit
5. Uji bersifat positif bila kaldu berwarna merah dalam waktu 30 menit setelah penambahan reagens.
  
  
Uji bersifat Negatif bila kaldU MR-VP tidak memperlihatkan perubahan warna setelah penambahan reagens..
             
             
10.4.1.3. Uji SITRAT .
             
              Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai satu satunya sumber karbon dan energi. Untuk uji ini dapat digunakan medium sitrat -Koser , berupa medium cair , atau medium simon sitrat  berupa medium padat.
              Simon s Citrat Agar merupakan medium sintetik dengan Na sitrat sebagai satu satunya sumber karbon, NH4+ sebagai sumber N dan bromthymol blue sebagai indikator pH, sedangkan medium sitrat koser tidak mengandung indikator. Bila mikroorganisme mampu menggunakan sitrat , maka asam akan dihilangkan dari medium biakan , sehingga meenyebabkan peningkatan pH dan mengubah warna medium dari hijau menjadi biru. Perubahan warna dari hijau menjadi biru menunjukkan bahwa , mikroorganisme mampu menggunakan sitrat sebagai satu satunya sumber karbon, sedangkan pada medium sitrat koser kemampuan menggunakan sitrat ditunjukkan oleh kekeruhan yang menandakan adanya pertumbuhan .
             
              Bahan yang diperlukan:
             
              1.Biakan : Escherichia coli.
                    Enterobacter aerogenes.
              Proteus Vulgaris
              Pseudomonas aeruginosa.

2.Media  : Simons citrat Agar.

Cara mengerjaakan :

1.  Tandai tabung simons citrat agar dengn nama , tanggal
     nama mikroorganisme yang diuji .
2. Inokulasi tabung agar dengan contoh biakan yang tipis.
     Dikarenakan inokulasi yang terlalu tebal kadangkala menyebabkan mikroorganisme seakan akan dapat tumbuh dalam simons citrat , sehingga hasil pengujian dapat memberikan hasil yang tidak benar.
3.  Inkubasi pada suhu 35OC selama 48 jam.
                   



Pada tabel dilihat karakteristik dari bacteri E.coli dan E. aerogenes.

Mikroorganisme
Indol
MR
VP
CITRAT
E.Coli
+
+
-
-
E.aerogenes.
-
-
+
+


                               10.5. Reaksi Biokimiawi pada Uji Coliform dan E.Coli

10.5.1. Hidrolisis gelatin.
          
           Gelatin adalah protein yang diperoleh sewaktu merebus tulang , tulang rawan atau tenunan hewani lainya. Protein ini bila didinginkan membentuk ” gel “ . Beberapa mikroorganisme tertentu mampu menguraikan molekul sehingga asam amino yang dihasilkan dapat digunalkan sebagai zat hara. Hidrolisis gelatin oleh mikroorganisme tersebut dikatalisasikan oleh ekoenzim yang disebut gelatinase. Gelatin yang telah dicerna tidak mampu membentuk gel dan bersifat cair. Kemampuan untuk mencernakan gelatin dapat digunakan dalam pencirian mikroorganisme. Sebagai contoh sarratia marcescens dapat dibedakan dari Klebsiella pneumonia atau Escherichia Coli berdasarkan kemampuan mencernakan gelatin .Hidrolisis gelatin dapat pula digunakan untuk mengetahui galur mikroorganisme , karena sering kali dikaitkan dengan produksi enzimuntuk menguraikan bahan pengikat tenunan untuk memudahkan penyebaran mikroorganisme.
           Dalam Laboratorium , pencairan gelatin diuji dengan cara menusukkan mikroorganisme yang akan diuji kedalam media semipadat  yang mengandung nutrient broth dan gelatin. Media ini diinkubasikan dan diamati kemampuan mikroorganisme mencairkan gelatin. Pada suhu 35OC , gelatin dapat mencair bila diinokulasikan dengan mikroorganisme yang mampu maupun yang tidak mampu mencairkan gelatin. Bila mikroorgsnisme mampu mencerna gelatin , maka media semi padat gelatin tetap bersifat cair setelah dikeluarkan dari lemari es. Sebaliknya bila mikroorganusme tidak mampu mencerna gelatin , maka media semipadat gelatin membeku kembali setelah dikeluarkan dari lemari es.



Bahan yang diperlukan

1. Biakan         : Escherichia Coli.
Bacillus Subtilis
Serattia marcescens

2. Midia : Gelatin


Cara kerja  :

1.Tandai tabung gelatin dengan nama tanggal dan mikroorganisme yang diujikan .            
2.          Media diinokulasi dengan cara menusukkan mjkroorganisme yang akan diujikan sedalam ¾ bagian dari  lapisan permukaan .
3. Inkubasi pada suhu 35OC  selama 24 jam.
4.Amati pertumbuhan dalam media gelatin , kemudian masukkan tabung kedalam lemari es.
5. Pencairan gelatin dapat dilihat dengan memiringkan tabung. Bila gelatin tetap dalam keadaan cair , maka mikroorganisme mampu mencerna atau menghidrolisis gelatin . Beberapa mikroorganisme mampu mencerna gelatin , namun memerlukan waktu yang lama. Ini berarati bahwa medium gelatin harus diinkubasi kembali selama 1 minggu sebelum dapat dinyatakan bahwa hasil pengujian bersifat negatif.
 .
10.5.2.Hidrolisis Urea.


Beberapa mikrooganisme mampu menghasilkan enzim urease yang menguraikan urea menjadi ammonium  dan CO2 .Aktivitas enzim urease ini dapat diamati dengan menumbuhkan mikroorganisme  dalam media biakan yang mengandung urea dan indikator pH ( biasanya phenol red ). Bila urea dihidrolisiskan , NH4+ terakumulasi dalam media biakan dan menyebabkan pH menjadi basa. Perubahan warna dari merah jingga menjadi merah ungu merupakan terjadinya reaksi hidrolisis uerea.
Urea bersifat labil , serhingga tidask dapat disterilisasi dengan autoklave.






Dibawah ini Gambar dari reaksi Hidrolisis urea.

H2N
                             Urease
                  C= O                                       2NH4 + CO2
                               H2O          
H2N                            
                                              Amonia karbon dioksida



Bahan yang diperlukan :

1.    Biakan : Escherichia Coli.
                        Proteus Vulgaris

2. Media biakan Agar urea ( agar miring)

Cara kerja:

1.    Tandai tabung dengan nama , tanggal , dan mikroorganisme yang diuji .
2.    Inokulasi urea agar miring dengan mikroorganisme .
3.    Inkubasi pada suhu 35OC selama 48 jam.
4.    Amati perubahan dari merah jinga menjadi merah ungu. Bila perubahan warna sulit diamati karena pertumbuhan yang subur pada permukaan agar miring, bandingkan bagian “ Slant “ dengan bagian “ butt “.

10.5.3 Hidrolisis Protein.
                 
                  Kasein adalah protein yang terdapat dalam susu . Protein susu ini seperti juga protein lainya terdiri dari asm amino. Asam amino ini dapat digunakan oleh mikroorganisme tertentu sebagai sumber karbon dan energi.
                  Bila susu sudah dicampur dengan media biakan umum, kasein dalam susu akan menyebabkan media biakan keruh .Kekeruhan dalam media biakan disebabkan kasein dalam susu bereaksi dengan ion Ca ++  dan membentuk Ca-kasein . Kompleks ini tidak larut dalam media , namun membentuk larutan koloidal, sehingga media biakan terlihat keruh .
                  Bila mikroorganisme menghasilkan eksoenzim kaseinase, yang menghidrolisis kasein, maka wilayah sekeliling koloni bacteri terlihat jernih.
                 
                  Kejernihan ini disebabkan molekul kasein diuraikan, asam amino yang di hasilkan dari proses penguraian ini larut dalam media, sehingga kekeruhan disekeliling koloni bacteri akan hilang
                  Uji ini merupakan cara sederhana sebagai petunjuk penguraian kasein olih mikroorganisme . Proteinase merupakan istilah umum yang digunakan bagi enzim yang menghidrolisiskan protein.

10.5.3.1.Bahan yang diperlukan

10.5.3.1.1.Escherichia coli.
10.5.3.1.2.Bacillus subtilis.
10.5.3.1.3.Lempengan agar yang berisi susu.

Cara mengerjakan :

1.Beri label pada lempengan agar .
2. Inokulasi lempengan dengan biakan yang disediakan.
                   Cara inokulasi sama dengan prosedur hidrrolisis zat pati.
                   Inkulasi lempengan dengan 1 mata ose biakan , kemudian sebarkan seluas 0,5 cm.
3. Inkubasikan pada suhu 35OC     selama 24 – 48 jam.
4. Periksa adanya hidrolisis kasein pada lempengan agar . Hidrolisis terlihat sebagai wilayah jernih sekeliling pertumbuhan bacteri. Bila tidak terjadi hidrolisis , wilayah sekeliling koloni tetap bersifat keruh.
5. Ukur luas diameter wilayah jernih , laporkan hasilnya dalam bentuk tabel seperti dibawah ini .                
                      

MIKROORGANISME
HIDROLISIS
POLISAKARIDA
PROTEIN

Hari I
Hari II
Hari I
Hari II
E.Coli




B.Subtilis









10.5.4.Uji Hidrogen Sulfida.
        
         Banyak protein kaya akan asam amino sestein dan methionin. Asam amio ini dihasilkan sewaktu protein dihidrolisiskan untuk memenuhi kebutuhan zat hara mikroorganisme. Pembentukan asam sulfida (H2S) oleh mikroorganisme menunjukkan adanya penguraian asam amino yang mengandung sulfur.
         Mikroorganisme yang menghasilkan desulfurase  sewaktu dibiakkan dalam media yang kaya dengan asam amino yang mengandung sulfur akan membentuk H2S .Fe++ yang  terdapat dalam media biakan beriaksi dengan H2S dan menghasilkan senyawa FeS yang berwarna hitam dan tidak larut dalam air.

        
           H       NH2                         desulfuras sestein                                            O
                                    O     
 HS      C       C      C                                 H2S+H2O   C   COOH +NH
                                   OH                                Asam piruvat
           H       H

            sestein                      


    H2S      +      FeSO4                                                        FeS      +      H2SO4
 Hidrogen             Ferro                                          Ferro                  Asam sulfat
 sulfida            sulfat                                  sulfida

           Produksi H2S dapat terlihat dengan menggunakan media yang mengadung polipeptida yang kaya asam amino yang mengandung sulfur dan ion Fe++.
Dalam praktikum akan digunakan media TSIA (Triple Sugar Iron Agar). Pada media ini H2S akan bereaksi dengan Fe menjadi FeS yang berwarna hitam . Jika lead acetate agar yang digunakan , maka H2S bereaksi dengan Pb menjadi PbS yang berwarna hitam.
TSIA digunakn terutama untuk mengidentifikasi bacteri gram negatif. Media ini mengandung tiga macam gula yaitu:glukose,laktose, sukrose, indikator merah fenol, danFeSO4 untuk memperlihatkan pembentukan H2S yang ditunjukkan dengan adanya endapan hitam.
Konsentrasi glukose adalah 1/10 dari konsentrasi laktose atau sukrose agar fermentasi glukose saja dapat terlihat reaksi dibaca setelah 24-48 jam , sehingga reaksi setelah kurun waktu ini tidak absah.


REAKSI YANG DAPAT TERLIHAT PADA TSIA
          
            Butt bersifat asam (kuning)           Glukose difermentasikan.
         Slant bersifat basa (merah)                                 


 


Pada seluruh media terlihat           Laktosa atau sukrose atau    
pembentukan asam. Seluruh          keduanya difermentasikan.
media berwarna kuning.
        
         Pembentukan gas di begian           Pembentukan gas, misalnya
         butt, media kadang kala                H2 dan CO2
         terpecah.
        
         Endapan hitam dibagian butt            Pembentukan H2S.

         Selurih media berwarna merah      Ketiga macam gula tidak
         bagian butt, dan slant berwarna    difermentasikan.
         merah


10.5.4.1.Bahan yang diperlukan

10.5.4.1.1.Biakan Escherichia coli.
10. 5.4.1.2.Media TSIA (tabung agar miring.)

10.5.4.2.Cara menerjakan.

10,5.4.2.1. Tandai tabung dengan nama biakan.
10. 5.4.2.2 Inokulasi tabung TSIA.
10.5.4.2.3.Inkubasi pada suhu 350C selama 24 jam.
10.5.4.2.4.Laporkan hasil pertumbuhan.











10.5.5.Uji dekarboxilase lisin.

Dekarboxilasi merupakan proses penguraian gugus karboxil dari suatu molekul organik. Proses dekarboxilasi asam amino lazimnya menghasilkan  CO2: molekul yang telah didekarboxilasikan digunakan sebagai pemuka dalam sintesis berbagai komponen sel.
Proses dekarboxilasi asam amino sering kali juga digunakan untuk menetralisasikan lingkungan asam. Sewaktu proses fermentasi,mikroorganisme seringkali menghasilkan hasil sampingan yang bersifat asam yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Enzim dekarboxilase mengenyahkan gugus asam dari asam amino, dan menghasilkan amina yang menyebabkan media pertumbuhan bersifat basa.
Proses dekarboxilasi lisin dapat diketahui dengan menumbuhkan mikroorganisme kedalam buiakan yang mewngandung lisin,karbohidrat yang dapat difermentasikan (glukosa) dan indikator pH untuk melihat perubahan pH, lazimnya  yang digunakan adalah : bromcresol purpel (BCP)
Asam yang dihasilkan dalam proses fermentasi glukosa akan menurunkan pH media biakan dan menyebabkan terjadi perubahan warna dari indikator pH.dari ungu menjadi kuning.
Dalam suasana asam ini proses dekarboxilasi lisin dapat berlangsung sehingga terjadi pembentukan amin yang menetralisasikan  suasana asam media pertumbuhan mikroorganisme. Proses netralisasi asam ini terlihat sebagai perubahan warna dari kuning menjadi ungu seperti sedia kala: perubahan warna menjadi ungu ini menunjukkan bahwa lisin mengalami dekarboxilasi.




            H    H   H   H    NH2                                      
                                                     O
                                                                  Dekarboxilasi lisin
N2H     C    C   C   C    C     C
                                                Suasana asam
 H   H   H   H    H               OH


 







Uji dekarboxilasi lisin merupakan salah satu uji yang digunakan dalam pencirian mikroorganisme , terutama yang menempati saluran pencernaan

10.5.5.1.Bahan yang diperlukan

1.    Enterobacter aerogenes,Citrobacter freundi
2.    Kaldu Dekarboxilase lisin yang mengandung lisin (LDC)
3.    Kaldu Dekarboxilase tanpa lisin.

10.5.5.2.Cara mengerjakan.

1.Tandai tabung LDC dan DC dengan nama, tanggal, dan mikroorganisme yang digunakan.
2. Inokulasi tabung LDC dan DC.
3. Lapisi media biakan yang telah diinokulasi dengan 1ml minyak mineral yang telah diseterilkan. Gunakan pipet pasteur untuk mengalirkan minyak kedalam tabung. Perhatikan bahwa ujung pipet tidak menyentuh media biakan yang telah diinokulasi.
4. Inkubasi pada suhu 35OC selama 48 jam.
5. Perhatikan adanya perubahan warna dalam media biakan setelah inkubasi 2 hari. Dekarboxilasi lisin ditunjukkan oleh warna ungu dalam kaldu.

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar